川崎病，即皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种系统性血管炎性综合征。该病多发生于5岁以下儿童，其主要危害是造成冠状动脉损伤，部分患儿需要进行冠状动脉搭桥术进行治疗。目前川崎病已经逐渐取代风湿性疾病成为儿童后天获得性心脏病的主要病因，尤其是在亚洲地区，近些年的川崎病患者数量不断上升［1，2］。目前对于川崎病的诊断主要依赖于临床症状、体征和心脏超声及实验室检查，但对于它的发病机制仍未明确。因此目前亟需发现有效的生物标记物，这不仅有助于川崎病的诊断，而且有望揭示该病的相关机制，发现有效的分子治疗靶点。
微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度为20 bp左右的内源性非编码单链RNA，其主要作用机制是降解靶基因的mRNA或抑制mRNA的翻译，进而发挥生物学功能［3］。miRNA与多种疾病的发生发展有关，不仅可以作为生物标记物用于疾病的诊断，而且还是治疗疾病的潜在分子靶点［4］。研究显示，miR-155、miR-208和 miR-499的表达异常与冠状动脉粥样硬化等心血管疾病有关［5-7］。但在川崎病中却鲜有报道。因此，本研究检测了并分析了这三种miRNA在川崎病中的表达及意义，初步探讨它们是否具有成为川崎病诊断与治疗标记物的潜能。
1 材料和方法
1.1 研究对象
本研究选取2015年10月至2019年2月期间在中山大学孙逸仙纪念医院住院确诊的52例川崎病患者作为实验组，同时随机选取20例在本院进行常规体检的健康儿童作为对照组。本研究是在本院伦理委员会批准后进行的。
纳入标准：①川崎病组为发热5 d以上，抗生素治疗无效；并伴有下列五项中的四项：双侧球结膜充血；唇、口腔皲裂、弥散性充血，杨梅舌；颈部淋巴结肿大；皮肤出现红斑、皮疹；手掌、足底出现潮红、硬肿及恢复期指（趾）端膜状脱皮等符合川崎病的诊断标准的患儿。②病人均未应用大剂量丙种球蛋白、激素、阿司匹林等针对川崎病的药物治疗，样本抽取在病程在4～9天。③患儿家属签署知情同意书后。
排除标准：①已经开始川崎病治疗的患儿；②同时患有过敏性紫癜等免疫性疾病者。
1.2 研究项目
1.2.1 临床资料 收集52例川崎病患者的一般临床资料，包括年龄、性别、采集样本前的病程、症状、体征、实验室检查指标等。
1.2.2 样本采集 本研究采集的52例样本为川崎病患者初诊时的外周血，并采集20例同一时期在本院进行体检的健康儿童的外周血。采集后的血液收集在含有EDTA的抗凝管中，以备后续试验。
1.3 miRNA提取和表达检测
取2 mL上述血液样本，根据试剂盒说明书采用单核细胞分离液试剂盒（北京Solarbio公司）分离出单核细胞，采用TRIzol（美国Invitrogen公司）提取RNA，并使用NanoDrop（美国Thermo公司）检测RNA的纯度和浓度。采用TaqMan®MicroRNA Assay试剂盒（美国Applied Biosystem公司）对miRNA进行反转录生成cDNA。采用QuantStudio 6（美国Applied Biosystem公司）分别对miR-155、miR-208和miR-499的表达进行实时荧光定量（RT-PCR）检测，同时以RNU6B作为内参对照miRNA进行定量分析。每个样本均进行3次平行检测，取平均值。
1.4 统计分析
本研究所检测的数据均采用SPSS 21.0进行统计分析。其中，分类变量采用卡方（χ2）检验或Fisher精确检验；连续变量采用t检验，统计值用平均值±标准差（mean±SD）表示。所有统计均采用双侧检验，以P＜0.05为具有统计学意义。
2 结 果
2.1 研究对象
如表1所示，本研究实验组所纳入的52例川崎病患儿平均年龄为1.52±1.06岁，其中包括27例男性和25例女性。对照组中的20例健康儿童的平均年龄为1.95±1.04岁，其中包括12例男性和8例女性。实验组与对照组在年龄（P=0.125）和性别（P=0.544）分布上没有显著性差异。
表1 川崎病患者与对照组的年龄和性别分布
年龄/岁性别/例（%）川崎病组（n=52）1.52±1.06对照组（n=20）1.95±1.04 P值0.125 0.544男 女27（51.9%）25（48.1%）12（60.0%）8（40.0%）
如表2所示，本研究中川崎病组中有冠脉损害16例，平均年龄为1.48±1.28岁，其中包括10例男性，6例女性；无冠脉损害36例，平均年龄1.53±0.96岁，其中包括17例男性，19例女性（见表2）。川崎病中冠脉损害组与无冠脉损害组在年龄（P=0.869）和性别（P=0.309）分布上没有显著性差异。
表2 川崎病中冠脉损害组与无冠脉损害组的年龄和性别分布
年龄/岁性别/例（%）冠脉损害组（n=16）1.48±1.28无冠脉损害（n=36）1.53±0.96 P值0.869 0.309男 女10（62.5%）6（37.5%）17（47.2%）19（52.8%）
2.2 临床资料
患儿临床表现中发热＞5 d者52例（100.0%），眼结膜充血37例（71.2%），口唇皲裂33例（63.5%），杨梅舌41例（78.8%），皮疹35例（67.3%），颈部淋巴结大36例（69.2%），手足硬肿26例（50%），指趾端脱皮31例（59.6%），肛周脱皮28例（53.8%），卡介苗接种处红肿3例（5.8%）。川崎病四季均可发病，尤以春季（3～5）居多，占36.5%（19/52），其次为冬季（12、1、2月）占26.9%（14/52），夏季（6～8月）占23.1%（12/52），秋季（9～11月）占13.8%（7/52）。川崎病中男女患病率略有不同，男女比1.08∶1（27∶25），男性多于女性 51.9%（27/52）VS 48.1%（25/52），χ2=0.38，P＞0.05。
2.3 miRNA-155、miRNA-208、miRNA-499在川崎病中的表达检测结果
本研究通过RT-PCR对所采集样本中miR-155、miR-208和miR-499的表达进行检测。检测结果以川崎病组对比对照组的相对表达量的形式表示为平均倍数±标准差）。统计结果发现，川崎病患者中的miR-155表达水平为正常对照组的2.07±0.27倍，并且具有显著性差异（P=0.018）（图1A）。而miR-208川崎病样本中的表达与对照组相比升高了1.81±0.67倍，但是未发现显著性差异（P=0.062）（图1B）；miR-499在川崎病样本中的表达升高了1.74±0.64倍，与对照组相比也未发现显著性差异（P=0.076）（图 1C）。虽然，miR-208和miR-499在川崎病中的表达升高不显著，但是已经十分接近临界值（0.05）。这种不显著性结果有可能会因为增大样本量而有所改变。这有待在将来的研究中进行验证。
2.4 miRNA-155在川崎病中冠脉损害中的表达检测
检测结果以川崎病组中miRNA相对表达量的形式表示为平均数±标准差。如图2所示，miRNA-155在有冠脉损害的川崎病中测出的相对表达量为4.33±0.62，无冠脉损害川崎病中的相对表达量为1.14±1.34，对照组相对表达量为1.02±0.68。冠脉损害组与无冠脉损害组及对照组比较均P＜0.05，具有统计学意义。而无冠脉损害组与对照组比较P=0.6595，两者之间无显著性差异。
3 讨 论
川崎病是儿童后天获得性心脏疾病的主要病因，对于未经过治疗的川崎病患儿冠脉损害的发生率25%，严重威胁患儿的生命和健康。本组中川崎病冠脉损害的发生率30.7%，高于文献报道［8］，这可能由于我院接受来自于基层医院的川崎病重症患者较多的缘故。目前川崎病发病机制尚不明确，虽然有研究显示感染性因素、免疫因素、遗传因素均会影响川崎病的发生，但是目前仍未阐明其具体机制。因此，目前急需鉴定出相关分子生物标记物，以促进川崎病的机制研究、临床诊断和治疗。
MiRNA在心血管疾病等多种疾病的发生发展中发挥重要作用，是潜在的诊断标记物或分子治疗靶点［5-7］。而在川崎病中也有关于miRNA的研究报道。研究发现，miR-130a、miR-143、miR-145、miR-223、miR-371以及miR-92a在川崎病患者中的表达升高［9-13］，而顾勇等的研究显示miR-145在川崎病中表达是降低的［14］。此外，miR-21、miR-195、miR-1249和miR-1260在川崎病中的表达也是降低的［15，16］。但是有关miRNA在川崎病中的作用机制还有待阐明。本研究检测了心血管疾病相关的三种miRNA，即miR-155、miR-208和miR-499在川崎病中的表达情况。
MiR-155属于典型的多功能性miRNA，研究表明miR-155具有调控炎性浸润，调节自噬，参与免疫反应等多种生物学过程，并且与癌症、心血管系统发育以及多种疾病有关［17，18］。研究显示，miR-155在扩张型心肌病患儿中的表达升高［19］，而沉默miR-155可以抑制病理性心肌肥大［17］。miR-155的高表达与冠状动脉粥样硬化有关，并且其表达与冠状动脉狭窄的损伤程度呈负相关［20］。崔萍萍等的研究发现川崎病患者中miR-155的表达升高［21］，而Ni FF等的研究显示miR-155在川崎病患者中的表达是降低的［15］。
本研究中的结果显示miR-155在川崎病患者中的表达升高，这与崔萍萍等的研究相一致。而与Ni FF等的研究结果不一致的原因可能在于他们的研究仅仅检测的是川崎病患者中调节性T细胞中miR-155的表达。样本量大小以及采集区域的不同也是需要考虑的因素。同时在本研究中显示miRNA-155相对表达量与冠脉损害呈正相关性，miRNA-155在有冠脉损害的川崎病中测出的相对表达量为（4.33±0.62），无冠脉损害川崎病中的相对表达量为（1.14±1.34），对照组相对表达量为（1.02±0.68），冠脉损害组miRNA-155相对表达量均显著高于无冠脉损害组和对照组比较，这对于川崎病诊断与治疗的潜在标志物具有一定的指导意义。但由于本文研究数目较少，仍需进一步深入研究。
MiR-208是心肌特异性miRNA，参与心肌发育及相关疾病，例如心肌肥大和纤维化。外周循环系统中miR-208的存在对心肌病变具有潜在预示作用。研究显示，心肌损伤大鼠的血清中miR-208表达水平显著升高［22］，而抑制心脏衰竭大鼠的miR-208表达有助于心脏功能的恢复和存活期的延长［23］。Pinchi E等的研究显示，miR-208可以作为急性心肌梗死的潜在诊断标记物，而且具有很高的特异性和敏感性［7］。miR-499也属于心肌特异型miRNA，其在心脏相关疾病中的诊疗价值已经逐步得到证实。研究显示miR-499在心肌肥大和心肌病中的表达升高，而miR-499的升高会引起心脏衰竭［24］。Adachi T等的研究发现急性心肌梗死患者血清中的miR-499表达是升高的，而且提示其可以作为川崎病的诊断标志物［25］。Zhou R等的研究显示急性心肌梗死中的miR-499表达升高会造成血管内皮损伤和炎症［26］。Corsten MF等的研究发现外周血中miR-208和miR-499的表达都对心血管疾病中的心肌损伤具有潜在预示作用［6］。在川崎病中还未有关于miR-208和miR-499表达的研究，而本研究中虽然发现miR-208和miR-499在川崎病中的表达升高，但无统计学意义。
此外，本研究还存在一定的局限性。首先，本研究的样本量有限，在后续研究中需要加大样本量以提高其准确性。其次，在未来的研究中可以扩大样本的采集区域，进行多中心的大样本量研究。而且，在以后的研究中还需对川崎病患者中miRNA的功能和机制进行探索。总之，本研究表明川崎病患者外周血中miR-155的表达显著升高，且miR-155表达水平与冠脉损害程度成一定程度的正相关，具有作为临床诊断标志物的潜能。而miR-208和miR-499的表达在川崎病中虽有升高，但差异并不显著，还有待进行大样本量的研究。
参考文献
［1］ Jiao F，Jindal AK，Pandiarajan V，et al.The emergence of Kawasaki disease in India and China［J］.Glob Cardiol Sci Pract，2017，2017（3）：e201721.
［2］ Lin MT，Wu MH.The global epidemiology of Kawasaki disease：Review and future perspectives［J］.Glob Cardiol Sci Pract.，2017，2017（3）：e201720.
［3］ Bartel DP.MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）：281-297.
［4］ He M，Chen Z，Martin M，et al.miR-483 Targeting of CTGF Suppresses Endothelial-to-Mesenchymal Transition：Therapeutic Implications in Kawasaki Disease［J］.Circulation research，2017，120（2）：354-365.
［5］ Qiu XK，Ma J.Alteration in microRNA-155 level correspond to severity of coronary heart disease［J］.Scand JClin Lab Invest，2018，78（3）：219-223.
［6］ Corsten MF，Dennert R，Jochems S，et al.Circulating MicroRNA-208b and MicroRNA-499 reflect myocardial damage in car-diovascular disease［J］.Circ Cardiovasc Genet，2010，3（6）：499-506.
［7］ Pinchi E，Frati P，Aromatario M，et al.miR-1，miR-499 and miR-208 are sensitive markers to diagnose sudden death due to early acute myocardial infarction［J］.J Cell Mol Med，2019，23（9）：6005-6016.
［8］ McCrindle Brian W，Rowley Anne H，Newburger Jane W，et al.Diagnosis，Treatment，and Long-Term Management of Kawasaki Disease.A Scientific Statement for Health Professionals From the American Heart Association［J］.Circulation，2017，135（17）：e927-e999.
［9］ Yun KW，Lee JY，Yun SW，et al.Elevated serum level of microRNA（miRNA）-200c and miRNA-371-5p in children with Kawasaki disease［J］.PediatrCardiol，2014，35（5）：745-752.
［10］Chen Y，Ding YY，Ren Y，et al.Identification of differentially expressed microRNAs in acute Kawasaki disease［J］.Mol Med Rep，2018，17（1）：932-938.
［11］Rong X，Jia L，Hong L，et al.Serum miR-92a-3p as a New Potential Biomarker for Diagnosis of Kawasaki Disease with Coronary Artery Lesions［J］.J Cardiovasc Transl Res，2017，10（1）：1-8.
［12］盛伟武，高春彪，管华玲.miRNA-145和miRNA-143在川崎病患儿血浆中的表达及意义［J］.现代检验医学杂志，2016，31（5）：34-37，41.
［13］周爱华，张营营，潘璐璐，等.川崎病外周血单个核细胞中miR-130a的表达［J］.中国循环杂志，2013，（z1）：24.
［14］顾勇，窦常胜，邰海服.miRNA-145、VEGF与川崎病患儿冠脉损伤关系的初步研究［J］.医学理论与实践，2019，32（10）：1472-1474.
［15］Ni FF，Li CR，Li Q，et al.Regulatory T cell microRNA expression changes in children with acute Kawasaki disease［J］.Clin Exp Immunol，2014，178（2）：384-393.
［16］Rowley AH，Pink AJ，Reindel R，et al.A study of cardiovascular miRNA biomarkers for Kawasaki disease［J］.Pediatr Infect Dis J，2014，33（12）：1296-1299.
［17］Seok HY，Chen J，Kataoka M，et al.Loss of MicroRNA-155 protects the heart from pathological cardiac hypertrophy［J］.Circ Res，2014，114（10）：1585-1595.
［18］Marques FZ，Vizi D，Khammy O，et al.The transcardiac gradient of cardio-microRNAs in the failing heart［J］.Eur JHeart Fail，2016，18（8）：1000-1008.
［19］Miyamoto SD，Karimpour-Fard A，Peterson V，et al.Circulating microRNA as a biomarker for recovery in pediatric dilated cardiomyopathy［J］.JHeart Lung Transplant，2015，34（5）：724-733.
［20］Zhu GF，Yang LX，Guo RW，et al.microRNA-155 is inversely associated with severity of coronary stenotic lesions calculated by the Gensini score［J］.Coron Artery Dis，2014，25（4）：304-310.
［21］崔萍萍，李成荣，李秋，等.微小RNA-155/微小RNA-21对急性期川崎病Toll样受体4表达的影响［J］.中华风湿病学杂志，2015，19（12）：813-818.
［22］Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury［J］.Clin chem，2009，55（11）：1944-1949.
［23］Montgomery RL，Hullinger TG，Semus HM，et al.Therapeutic inhibition of miR-208a improves cardiac function and survival during heart failure［J］.Circulation，2011，124（14）：1537-1547.
［24］Matkovich SJ，Hu Y，Eschenbacher WH，et al.Direct and indirect involvement of microRNA-499 in clinical and experimental cardiomyopathy［J］.Circ Res，2012，111（5）：521-531.
［25］Adachi T，Nakanishi M，Otsuka Y，et al.Plasma microRNA 499 as a biomarker of acute myocardial infarction［J］.Clin Chem，2010，56（7）：1183-1185.
［26］Zhou R，Huang W，Fan X，et al.miR-499 released during myocardial infarction causes endothelial injury by targetingα7-nAchR［J］.JCell Mol Med，2019，23（9）：6085-6097.
