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Lingnan Modern Clinics in Surgery ›› 2019, Vol. 19 ›› Issue (06): 701-705.DOI: 10.3969/j.issn.1009?976X.2019.06.012

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The role of lncRNA PANDAR in tongue squamous cell carcinoma

FANG Songcheng, XIU Xia, MAI Lianxi, XIE Shule, LIN Zhaoyu, JIAO Jiuyang   

  1. 1. Department of Stomatology, Donghua hospital, Dongguan 523110, China; 2. Department of Stomatology, Huangdao District Central Hospital, Qingdao 266000, China; 3. Department of Stomatology, Sun Yet?san Memorial Hospital,Guangzhou 510120, China.
  • Contact: JIAO Jiuyang

长非编码RNA PANDAR在舌鳞状细胞癌中的功能研究

方松城, 修霞, 麦潋曦, 谢舒乐, 林钊宇, 焦九阳*   

  1. 1. 东莞东华医院口腔科,广东东莞523110;2. 青岛市黄岛区中心医院,山东青岛266000;3. 中山大学孙逸仙纪念医院口腔科,广州510120
  • 通讯作者: 焦九阳
  • 基金资助:
    国家自然科学基金青年项目;国家自然科学基金青年项目;中国博士后科学基金

Abstract: Objective To investigate the expression of lncRNA PANDAR in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) and explore its function and mechanism. Methods The expression of PANDAR was determined by qRT?PCR in tongue squamous cell carcinoma specimens and cell lines. The CCK8 assays and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells with or without PANDAR deletion. The expression of Bax in Cal27 and SCC25 cells was detected by qRT?PCR and Western blot. Results LncRNA PANDAR was significantly upregulated in TSCC tissues and cell lines. PANDAR knockdown improved cell proliferation, but suppressed cell apoptosis. PANDAR deletion was beneficial to the expression of Bax in Cal27 and SCC25 cells. Conclusion PANDAR is highly expressed in TSCC tissues and cells. PANDAR downregulation in TSCC cells promotes cell proliferation, but inhibits cell apoptosis through inhibiting Bax expression.

Key words: tongue squamous cell carcinoma., lncRNA, PANDAR, Bax

摘要:

长非编码RNA PANDAR在舌鳞状细胞癌中的功能研究

方松城1, 修霞2, 麦潋曦3, 谢舒乐3, 林钊宇3, 焦九阳3*

[摘要] 目的 探究长非编码RNA(lncRNA)PANDAR在舌鳞状细胞癌中的表达及调控机制。方法 利用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)检测PANDAR在舌鳞癌临床样本及细胞系的表达水平,通过CCK-8法及流式细胞仪分析检测敲低PANDAR对舌癌细胞增殖和凋亡的影响。qRT-PCR和Western-blot检测敲低PANDAR对凋亡相关基因Bax表达的影响。结果 LncRNA PANDAR在舌鳞癌样本和细胞系内均显著高表达。敲低PANDAR可抑制Cal27和SCC25细胞的增殖并促进其凋亡。此外,敲低PANDAR有利于Bax蛋白的表达。结论 PANDAR在舌鳞癌组织中高表达。PANDAR通过下调促凋亡基因Bax的表达,促进舌鳞癌细胞的增殖并抑制其凋亡。

[关键词] 长非编码RNA;PANDAR;Bax;舌鳞状细胞癌

舌鳞癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤,55岁左右的人群为舌鳞癌高发群体,但近年来逐渐呈现年轻化的趋势[1,2]。目前已知多种因素均能导致舌鳞癌的产生,但具体发生机制尚不明确[3]。寻找新的关键基因或标志物利于舌鳞癌的深入认识,也有助于舌鳞癌的早期诊断、靶向治疗以及改善患者预后[4,5]

Long non-coding RNA(lncRNA)是长度大于200 nt一类非编码RNA,其作用广泛,机制复杂。近年来研究发现lncRNA可以参与多种生物学功能,同时也是癌症相关的重要调控因子[6,7]。长非编码RNA PANDAR是定位于人类第6号染色体上的一种非编码RNA,其长度约为1500 bp,研究发现它与p53存在相互作用,能够调控多种凋亡相关蛋白的表达[8,9]。BAX(Bcl-2 associated X protein,BAX)基因属于Bcl-2家族成员,广泛表达于多种组织,能够促进细胞凋亡[10,11]。已有研究发现BAX与多种恶性肿瘤的发生发展相关,包括肝癌,乳腺癌等[12,13]。目前尚未见到PANDAR与舌鳞癌的相关研究。本研究将探讨PANDAR在舌鳞癌中的表达及生物学功能,并检测PANDAR与BAX在舌鳞癌中的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本及细胞系 收集东莞东华医院口腔科及中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科2016年2月至2018年5月手术切除的舌鳞癌及其癌旁组织共51例,所有舌鳞癌病例均有病理学诊断证实,其中男 27例,女24例,年龄(54.6±9.5)岁。所有患者均已被告知并签署由本院伦理委员会批准的知情同意书。口腔癌细胞系Cal27,SCC9,SCC25,HSC3,HSC6和HOK购自中国科学院细胞库(上海)。

1.1.2 试剂 Lipofectamine 3000购买于美国Invitrogen公司;PrimeScriptTM RT reagent Kit购买自日本TAKARA公司;Bax抗体购买自CST公司,GAPDH抗体购自Proteintech公司购买。si-NC序列为:GTAGTGAGATGCAGATGATAA,siRPANDAR#1序列为 GCAATCTACAACCTGTCTT,siRPANDAR#2序列为TTTCGAACGGAACAGAGACUUAUACAGATT,由广州锐博生物有限公司合成。RPANDAR qRTPCR上游引物序列为CTGTTAAGGTGGTGGCATTG,RPANDAR下游引物序列为GGAGGCTCATACTGGCTGAT。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 Cal27,HSC3,HSC6和HOK细胞用含10%FBS(Gibico)的DMEM培养基培养。SCC9和SCC25细胞用含10%FBS(Gibico)的DMEM/F12培养基培养。放置于37℃,5%CO2的培养箱中,取生长对数期细胞进行实验。

1.2.2 RNA提取及qRT-PCR TRIZOL法提取组织及细胞中的总RNA,PrimeScriptTM RT reagent Kit反转为相应的cDNA。按照SYBR Green PCRMaster Mix的说明书,以cDNA为模板进行qRT-PCR检测,以GAPDH为内参进行表达量的计算。

1.2.3 siRNA的转染 取对数生长期的舌鳞癌细胞接种于6孔板中,至细胞融合度达到70%左右时,按照Lipofectamine 3000的说明书对转染适量的siRNA及相应的对照siRNA。转染6~8小时后更换新鲜培养基,并于转染的48小时后收集细胞沉淀。

1.2.4 CCK8检测 将转染PANDAR siRNA及对照siRNA后的Cal27和SCC25细胞消化并接种于96孔板,放置与37℃,5%CO2的培养箱中培养。之后在 24 h,48 h,72 h每孔分别加入 10μL的CCK-8,利用酶标仪450 nm检测相应OD值,并绘制增殖曲线。

1.2.5 细胞凋亡检测 收集转染48小时后的细胞,按照Annexin V-FITC Apoptosis Staining/Detection试剂盒的说明书(美仑生物),对细胞进行标记,并利用流式细胞分析仪进行检测。

1.2.6 蛋白质印迹法(Western blot) 收集细胞沉淀,用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。离心收集上清,加入5×loading buffer,100℃煮5分钟。准备SDS-PAGE胶,取适量样品上样。80 V恒压30分钟,120 V恒压1小时,进行转膜。封闭1小时后,分别使用Bax和GAPDH一抗4℃过夜。TBST洗膜3次后,孵育二抗1小时。TBST洗膜3次后,加入ECL发光液进行曝光。

1.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 7软件进行分析,qRT-PCR和细胞增殖及凋亡率的差异显著性用的是Student t检验进行统计。P值小于0.05则认为差异显著,*表示 P<0.05,**表示 P<0.01,***表示P<0.001。

2 结 果

2.1 PANDAR在舌鳞癌组织及细胞中高表达

我们在51例舌鳞癌及其癌旁正常组本中检测PANDAR的表达水平,与癌旁组织相比PANDAR在舌鳞癌的表达显著升高(P<0.05)(图1A)。此外,与永生化的正常口腔上皮细胞株HOK相比,PANDAR在多数舌鳞癌细胞株内表达上调,其中Cal27和SCC25细胞上调最为显著(图1B)。

图1 PANDAR在舌鳞癌组织和细胞内的表达 A:51例舌鳞癌组织及癌旁组织中PANDAR的表达情况;B:不同舌鳞癌细胞系Cal27,SCC9,SCC25,HSC4,HSC6及对照细胞NOK中PANDAR的表达水平。*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.2 敲低PANDAR抑制舌鳞癌细胞增殖

我们分别转染PANDAR-specific siRNA及对照NC-specific siRNA到Cal27及SCC25中,48小时后收集细胞。利用qRT-PCR检测PANDAR-specific siRNA的敲低效率,验证siRNA的效果,结果发现两条siRNA在两种细胞系中均有良好的敲低效率(图2A)。我们进一步研究敲低PANDAR表达对舌鳞癌增殖的影响。我们分别选取转染后24小时,48小时,72小时的Cal27及SCC25细胞,利用CCK-8试剂盒检测450 nm下的OD值,并绘制相应曲线(图2B)。结果发现,在两种细胞中,敲低PANDAR的表达均能够有效抑制舌鳞癌细胞的增殖。

图2 沉默PANDAR显著抑制舌鳞癌细胞增殖 A:在Cal27和SCC25细胞中,PANDAR-siRNA特异性敲低后,PANDAR的表达情况;B:在Cal27和SCC25细胞内PANDAR特异性敲低后,细胞的增殖情况。*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.3 敲低PANDAR促进舌鳞癌细胞凋亡

在明确了PANDAR能够有效促进舌鳞癌增殖的基础上,我们进一步使用Annexin V-FITCApoptosis Staining/Detection试剂盒检测PANDAR对舌鳞癌细胞凋亡的作用。将PANDAR-specific siRNA及对照NC-siRNA转染至Cal27及SCC25细胞48小时后,收集细胞进行Annexin V-FITC染色并利用流式细胞仪对PANDAR敲低前后舌鳞癌细胞的凋亡水平进行检测。结果发现在两种舌鳞癌细胞中,敲低PANDAR能够显著促进舌鳞癌细胞的凋亡(图3A和B)。

2.4 PANDAR对凋亡相关蛋白的影响

图3 沉默PANDAR显著促进舌鳞癌细胞凋亡 A:在Cal27细胞中,PANDAR-siRNA特异性敲低后,细胞凋亡情况;B:在SCC25细胞内PANDAR特异性敲低后,细胞的凋亡情况。*表示P<0.05,**表示P<0.01

有研究发现PANDAR与p53存在相互作用,并能影响 Bcl-2 家族凋亡相关基因的表达[14,15]。由此,我们推测在舌鳞癌中,PANDAR可能影响了p53相关通路及Bcl-2家族相关蛋白。为了验证这种设想,我们分别向Cal27及SCC25中转染PANDAR-specific siRNA及对照NC-siRNA,48小时后收集细胞,分别检测BAX,PUMA,NOXA和BID的mRNA及相应蛋白的表达水平(图4A-D)。结果发现敲低PANDAR后,促凋亡基因BAX的mRNA及蛋白的表达水平均发生了明显的上调(P<0.05)。

图4 沉默PANDAR对凋亡相关蛋白的影响 A:在Cal27细胞中,转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后,凋亡相关基因BAX,PUMA,NOXA和BID mRNA的表达水平;B:在Cal27细胞中,转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后,BAX蛋白表达的变化;C:在SCC25细胞中,转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后,凋亡相关基因BAX,PUMA,NOXA和BID mRNA的表达水平;D:在SCC25细胞中,转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后,BAX蛋白表达的变化。*表示P<0.05,**表示P<0.01

3 讨论

近年来,大量研究发现lncRNA广泛参与调控细胞的多种生物功能,包括细胞分化,细胞增殖,细胞凋亡等,其中与肿瘤的相关性也不断被揭示[16,17]。虽然 UCA1、MEG3 和 MALAT1 已被证实参与舌鳞癌的进展[18-20],但是仍未能完全揭示lncRNA对舌鳞癌发生发展的调控作用。

在前期研究中,我们收集舌鳞癌及癌旁组织进行lncRNA表达谱分析,并鉴定出了一批在舌鳞癌组织内显著高表达的lncRNA[21],其中PANDAR在舌鳞癌组织内显著高表达其排名靠前,而目前没有关于PANDAR与口腔癌的相关报道。PANDAR定位于人类第6号染色体上,长约1500 bp,在DNA损伤的情况下可以参与p53通路介导凋亡作用,并能够调控部分凋亡相关蛋白[14]。同时,已有研究证实PANDAR与肝癌、胃癌的肿瘤生物学行为密切相关[8,14,22]。本课题对 PANDAR 在舌鳞癌中的表达及功能进行初步研究。首先,我们在51例舌鳞癌及其癌旁组织和舌鳞癌细胞株中检测了PANDAR的表达,PANDAR在舌鳞癌组织和大部分舌鳞癌细胞株内中显著高表达,其中Cal27及SCC25中PANDAR的表达最为突出。因此,我们利用舌鳞癌细胞系Cal27及SCC25研究了PANDAR对舌鳞癌细胞的增殖与凋亡的影响。功能研究显示,在舌鳞癌细胞中转染PANDAR-siRNA和NC-siRNA后Cal27和SCC25细胞的增殖能力被有效抑制,且舌鳞癌细胞的凋亡显著增加。有研究证实PANDAR与p53介导的凋亡通路密切相关,而p53通路能够调控Bcl-2家族的多种凋亡相关基因的表达[8]。因此,我们推测PANDAR可能是通过p53通路调控Bcl-2家族凋亡相关蛋白的表达,继而影响了舌鳞癌细胞的增殖与凋亡。随后,我们检测了p53下游的凋亡相关基因的表达,包括BAX、PUMA、NOXA、BID[23]。结果显示,沉默PANDAR后促凋亡基因BAX的mRNA水平和蛋白水平都发生了明显的上调,说明PANDAR是通过抑制p53下游的促凋亡基因BAX的表达,进而促进舌鳞癌细胞的增殖并抑制其凋亡。

目前已有研究证实在PANDAR在瘤内的高表达往往与患者的不良预后成密切相关[14,15,24],我们将在之后的研究中收集更多的舌鳞癌样本检测PANDAR的表达,分析PANDAR的表达与舌鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。lncRNAs可以通过改变染色体构象,维持mRNA稳定性,调控靶基因转录,参与蛋白质翻译后修饰等在转录水平上调控下游靶基因[25,26]。PANDAR 有可能采用上述一种方式调控BAX的表达,我们将在后续实验中通过ChIRP-seq实验,研究与PANDAR有结合的DNA;或通过RNA pulldown实验,研究与PANDAR结合的蛋白。

综上所述,PANDAR在舌鳞癌组织及细胞内显著高表达,敲低PANDAR后抑制促凋亡基因BAX在mRNA和蛋白水平的表达,进而抑制了舌鳞癌细胞的增殖,并促进其凋亡。

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The role of lncRNA PANDAR in tongue squamous cell carcinoma

FANGSongcheng1,XIU Xia2,MAILianxi3,XIE Shule3,LIN Zhaoyu3,JIAOJiuyang3
1.Department of Stomatology,Donghua hospital,Dongguan 523110,China;2.Department of Stomatology,Huangdao District Central Hospital,Qingdao 266000,China;3.Department of Stomatology,Sun Yet-san Memorial Hospital,Guangzhou 510120,China.

[Abstract] Objective To investigate the expression of lncRNA PANDAR in tongue squamous cell carcinoma(TSCC)and explore its function and mechanism.Methods The expression of PANDAR was determined by qRT-PCR in tongue squamous cell carcinoma specimens and cell lines.The CCK8 assays and flow cytometry were used to detect cell proliferation and apoptosis of tongue squamous cell carcinoma cells with or without PANDAR deletion.The expression of Bax in Cal27 and SCC25 cells was detected by qRT-PCR and Western blot.Results LncRNA PANDAR was significantly upregulated in TSCC tissues and cell lines.PANDAR knockdown improved cell proliferation,but suppressed cell apoptosis.PANDAR deletion was beneficial to the expression of Bax in Cal27 and SCC25 cells.Conclusion PANDAR is highly expressed in TSCC tissues and cells.PANDAR downregulation in TSCC cells promotes cell proliferation,but inhibits cell apoptosis through inhibiting Bax expression.

[Key words] lncRNA;PANDAR;Bax;tongue squamous cell carcinoma.

doi:10.3969/j.issn.1009-976X.2019.06.012

中图分类号:R739.86

文献标识码:A

基金项目:国家自然科学基金青年项目(81602379,81903045);中国博士后科学基金(2018M643352)

作者单位:1.东莞东华医院口腔科,广东东莞523110;2.青岛市黄岛区中心医院,山东青岛266000;3.中山大学孙逸仙纪念医院口腔科,广州510120

*通讯作者:焦九阳,Email:jiaojysun@sina.com

Corresponding author:JIAOJiuyang,jiaojysun@sina.com

(收稿日期:2019-08-21)

关键词: 长非编码RNA, Bax, 舌鳞状细胞癌, PANDAR

CLC Number: