乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，是女性第二大恶性肿瘤，发病年龄日趋年轻化，严重威胁女性身心健康［1］。约15%～20%的乳腺癌患者会发生骨、肺和脑转移，乳腺癌骨转移的5年生存率仅为20%［2］。研究与开创各类治疗乳腺癌的药物和方法具有十分重要的意义。
灵菌红素（prodigiosin，PG）是一类天然红色素家族的总称，由多种放线菌和细菌属产生的具有多种生物学活性的次级代谢产物，PG的生物学活性主要包括免疫抑制、抗肿瘤、抗细菌、抗真菌、抗疟疾等［3］。多项研究发现PG在治疗肿瘤方面具有重大潜力，美国癌症研究所Melvin等［4］研究发现PG浓度为2.1 μmol/L时对57中不同肿瘤细胞具有抗肿瘤活性、对正常细胞则无明显毒副作用，提示PG对肿瘤细胞作用具有靶向性。既往研究显示PG能够诱导肝癌细胞［5］、脑胶质母细胞瘤细胞［6］、口腔鳞癌细胞［7］、急性淋巴细胞白血病细胞［8］等。然而尚不清楚其对乳腺癌MCF-7细胞的凋亡调控作用和机制，因此本研究拟通过体外实验探讨PG调控人乳腺癌细胞增殖和凋亡中发挥的作用及分子机制。
1 材料与方法
1.1 人乳腺癌细胞获取
人乳腺癌细胞系MCF-7购于中国科学院上海生命科学研究院生命化学与细胞生物学研究所。
1.2 试剂耗材
灵菌红素Prodigiosin（CAS号 56144-17-3，Sig-ma公司），MEM培养基（Gibco公司），Bim抗体（#2933，CST公司），β-Tubulin Antibody抗体（#2146，CST公司），CCK8试剂盒（Catalog no.C0009，碧云天公司），TUNNEL试剂盒（Catalog no.12 156 792 910；Roche公司），慢病毒LV-sh Bim购自百恩维生物。
1.3 细胞处理
培养MCF-7细胞，使用不同浓度PG培养液处理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），于24、48、及72小时收集细胞，MTT检测细胞增值率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。RT-PCR及Western Blot检测Bim（Bcl-2-interacting mediator of cell death）表达情况。为了进一步明确灵菌红素通过Bim调控MCF-7细胞凋亡，构建Bim siRNA。采用实时荧光定量PCR方法检测MCF-7细胞中Bim表达情况以确保沉默效率；检测MCF-7细胞中Bim沉默后，PG对MCF-7细胞的凋亡诱导情况。
1.4 MTT实验
取对数生长期MCF-7细胞，重悬浮后调整细胞浓度为1×104个细胞/孔的密度铺于96孔板中。24小时后分别加入不同浓度的PG培养液处理（0、1、2、4、8、16 μg/mL），每个浓度组平行4孔。PG处理24、48、及72 h后每孔加入MTT 100 μL，置于培养箱中4 h。弃上清、加入DMSO 100 μL，避光震荡10 min后使用酶标仪在570 nm波长检测各孔吸光度值。细胞存活率=测试组OD平均值/对照组OD平均值×100%。
1.5 TUNEL实验
消化对数生长期细胞，依据说明书将MCF-7细胞1×105/mL加入96孔板，分别给予不同分组刺激后，移除上清液并无菌磷酸缓冲盐溶液（PBS）清洗，配置TUNEL孵育液并加入MCF-7细胞中孵育1 h，弃去TUNEL并PBS清洗一遍，加入DAPI（1 μg/mL）避光孵育15 min，加入抗荧光淬灭液，最后荧光显微镜下观察荧光并拍照。
1.6 流式细胞（FCM）实验
依据说明书将MCF-7细胞以1×106/孔接种于6孔板，分别给予不同分组刺激后，移除上清液、PBS清洗、胰酶消化、血清终止，离心后重悬浮细胞，调整细胞密度为 5×105～1×106/mL。取100 μL细胞悬液至流式细胞管中，加入Annexin V-FITC 5 μL和10 mg/L碘化丙啶（PI）10 μL，混匀后室温避光孵育15 min，加入400 μL结合缓冲液，流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率。增殖指数（PI）=（S+G2/M细胞数）/（G0/G1+S+G2/M细胞数）×100%；凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/细胞总数。
1.7 RNA提取和Real-time RT-PCR
收集处理好的各组细胞、PBS洗涤后提取RNA，使用逆转录试剂盒PrimeScriptTMRT reagent Kit将RNA逆转录为cDNA。罗氏Light-Cycler PCR仪进行扩增，程序为95℃预变性10 min，95℃变性 5 s，60℃退火34 s，40次循环后，95℃变性15 s，60℃退火1 min，95℃再变性 15 s，GAP-DH 作为内参。引物序列为：GAPDH-F：5′-CCA GAA CAT CAT CCC TGC CTC TAC T-3′，GAPDH-R：5′-GGT TTT TCT AGA CGG CAG GTC AGG T-3′；Bim-F：5′-CTG CAG ATA TGC GCC CAG AGA T-3′，Bim-R：5′-CACCAGGCGGACAATGTA ACG-3′。
1.8 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差（
）表示；组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 PG对MCF-7细胞增殖的影响
MTT法检测PG处理后MCF-7细胞的生长情况，通过公式计算细胞存活率。实验结果显示PG对MCF-7细胞增殖具有显著抑制作用，抑制作用呈时间浓度依赖。PG对MCF-7细胞在不同时间点的半数抑制浓度（IC50）不尽相同，在24、48及 72 h的 IC50值分别为 11.8、6.2、3.9 μg/mL。见图1。
2.2 PG对MCF-7细胞周期的影响
为了进一步检测PG对MCF-7细胞生长增殖的影响，我们采用流式细胞仪进行细胞周期分析。结果显示在PG处理下，处于S期的MCF-7细胞数目显著升高，作用效果呈浓度依赖性，结果提示PG能影响MCF-7细胞的增殖周期。PG处理后MCF-7细胞S期显著减少、增殖指数下降，G1期显著增加，提示PG通过抑制S期细胞DNA复制，从而抑制MCF-7细胞进一步分裂增殖。（图2）。
2.3 PG对MCF-7细胞凋亡的影响
为检测PG对MCF-7细胞凋亡的影响，我们采用流式细胞仪检测。结果显示PG能促进MCF-7细胞凋亡，并呈剂量浓度依赖性。对照组MCF-7细胞凋亡率约 3.6%，1、2、4 μg/mL的 PG处理MCF-7细胞24小时后，其早期凋亡率呈浓度梯度上升趋势，此外PG促凋亡效果呈剂量依赖性（图 3）。
2.4 PG通过促进Bim调控MCF-7细胞凋亡
上面研究显示PG能够促进MCF-7细胞凋亡，然而其具体机制不清。Bim是重要的凋亡相关蛋白，因此我们检测PG是否通过Bim从而调控凋亡。RT-PCR及Western blot检测结果显示PG能够促进MCF-7细胞内Bim mRNA及蛋白的表达，并且呈浓度、时间依赖性（图4）。
鉴于PG能够上调MCF-7细胞中凋亡相关蛋白Bim的表达，我们推测PG可能通过促进Bim调控MCF-7细胞凋亡。为了验证这一假设，我们采用特异性Bim小干扰siRNA沉默MCF-7细胞内Bim表达，将Bim-siRNA及对照siRNA分别转染MCF-7细胞，24小时后加入PG处理。RT-PCR及Western Blot结果显示Bim-siRNA转染后，MCF-7细胞内Bim RNA和蛋白表达水平显著下降。流式细胞仪检测显示Bim-siRNA能抑制PG对MCF-7细胞凋亡促进作用，MCF-7细胞细胞早期凋亡率明显减少，提示PG通过促进Bim调控MCF-7细胞凋亡（图 5/6）。
3 讨论
乳腺癌是发生于乳腺上皮组织的恶性肿瘤，研究显示乳腺癌发病率已跃升至女性恶性肿瘤的第二位、并且具有年轻化趋势。乳腺癌的高发病率和高死亡率已经严重威胁着女性的身心健康，其预防和治疗已成为国际急需解决的难题。
PG一类由多种细菌、放线菌产生的具有多种生物活性的次级代谢产物，其分子结构特征是含有一个三吡咯环的大共轭体系骨架。PG具有抗肿瘤活性、免疫抑制活性和抗微生物活性，因而得到广泛的研究。1977年Fullan等［9］首次证实PG在体内具有抗肿瘤活性，进一步研究发现PG对多种肿瘤细胞均具有抗肿瘤活性。鉴于PG良好的抗肿瘤活性，药物学家已经合成了多种PG衍生物，如GX15-070具有更好的免疫抑制活性和更低的毒性，已经进入临床Ⅰ/Ⅱ试验［10］。既往研究显示PG能通过诱导凋亡发挥抗肿瘤活性，其能对包括结肠癌、胃癌、肝癌、淋巴细胞瘤等多种肿瘤细胞发挥促凋亡作用。Yenkejeh等［5］发现PG能抑制原发性肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、效果呈剂量依赖性，并且PG是通过抑制survivin蛋白从而发挥其促凋亡活性。Cheng等［6］发现胶质母细胞瘤细胞中PG通过激活JNK通路及抑制AKT/mTOR通路，从而促进自噬性细胞死亡。Campàs等［11］发现PG能诱导慢性B细胞淋巴瘤性白血病患者的B细胞凋亡，细胞半数抑制率IC50位116±25 nM。Cheng等［7］发现口腔鳞状上皮细胞癌细胞中PG通过P62/LC3-I/LC3-II通过促进细胞自噬性细胞死亡。此外PG还通过激活P38-MAPK磷酸化，从而诱导Jurkat细胞凋亡［12］。PG还具有拓扑异构酶的双重活性，能诱导单链和双链DNA裂解，从到引起细胞周期阻滞，此过程伴或不伴有细胞凋亡［13］。
本文研究了PG抗乳腺癌的药效作用，及其抗癌机制做了初步探讨。MTT结果显示PG能抑制肿瘤细胞增殖、且与药物浓度和作用时间呈正相关，作用24小时的IC50值为24 μg/mL。流式细胞仪检测发现PG能通过抑制S期MCF-7细胞DNA复制使其停滞与G2期，从而抑制其进一步分裂增殖。随后本研究采用流式细胞仪及TUNNEL实验检测PG调控MCF-7细胞凋亡的作用，流式检测发现低浓度的PG在短时间内诱导MCF-7细胞凋亡并不明显，但随着作用时间延长以及药物浓度升高，MCF-7细胞凋亡率呈上升趋势，提示PG诱导MCF-7细胞凋亡呈时间、药物浓度依赖性。
Bim的全称是Bcl2 interaction mediator of cell death，Bim接到凋亡刺激后就会与LC8一起从复合体上解离出来游离在胞浆中，并拮抗LC8和Bcl2的功能、从而诱导细胞凋亡［14］。既往研究显示Bim具有抗肿瘤活性，表达与多种恶性肿瘤，如乳腺癌、前列腺癌、胃癌及非小细胞肺癌等，Bim表达上调能引起肿瘤细胞凋亡［15］。为了研究Bim在PG诱导MCF-7细胞凋亡中的作用，本研究采用RT-PCR及Western Blot检测发现PG能诱导MCF-7细胞中Bim高表达，提示PG可能通过Bim发挥其促凋亡作用。进一步我们采用siRNA将MCF-7细胞中Bim沉默，流式细胞检测显示Bim沉默能抑制PG对MCF-7细胞的凋亡诱导作用。
综上所述，本研究通过干扰RNA等试验手段发现灵菌红素与MCF-7细胞增殖凋亡进程，并且灵菌红素能通过上调Bim，从而抑制人乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡。研究提示灵菌红素作为新型抗肿瘤药物，具有一定的应用前景，其具体作用机制仍有待进一步研究。
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