Toll样受体在强直性脊柱炎患者MSC中的作用研究

李玉希　王鹏　谢中瑜　李进腾　沈慧勇*

【摘要】　目的　研究强直性脊柱炎（AS）患者间充质干细胞（MSC）中的Toll样受体表达及其对MSC免疫调节的调控作用。方法　首先利用流式细胞分析的方法鉴定AS患者骨髓腔中分离培养MSC是否满足特定细胞表型；然后利用RT－PCR的方法检测AS患者MSC中的Toll样受体表达情况；接着分别应用qRT－PCR检测AS患者MSC中TLR3和TLR4的表达水平；最后分别用特定激动剂激活TLR3和TLR4后，利用ELISA检测AS患者MSC中IL－6的分泌情况。结果　AS患者MSC不表达CD34、CD45和HLA－DR，表达CD29、CD90和CD105；RT－PCR结果显示ASMSC表达TLR1、2、3、4、5、6、8，几乎不表达TLR7、9、10；qRT－PCR显示AS患者MSC中TLR3较正常人降低47.5%，TLR4较正常人降低了34.8%；TLR3和TLR4激活后，AS患者MSC中IL－6的分泌较前增加，分别增加了8.3倍13.8倍。结论　AS患者MSC中TLR3和TLR4表达和功能均异常，在AS患者MSC免疫调节中起重要的调控作用。

【关键词】　强直性脊柱炎；间充质干细胞；Toll样受体

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一种常见的慢性自身免疫性疾病，以全身多发炎性疼痛和病理性成骨为主要特点，无有效的治疗手段，预后较差，发病机制至今未明［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一种存在于机体多种组织中具有多种分化潜能的细胞，MSC具有广泛的免疫调节能力［2］。本课题组的基础研究发现AS患者MSC的免疫调节能力存在异常，可能是导致其发病的重要原因［3］。但AS患者MSC发生免疫调节异常的机制至今尚不明确。Toll样受体（Toll－like receptors，TLRs）是一种模式识别受体，已经被多个研究证实对MSC的免疫调节能力中起重要的调控作用［4－6］。因此，为进一步明确AS患者MSC中的TLRs表达及功能是否异常，是否是导致其MSCs发生免疫调节异常的原因，我们设计并实施了本实验研究。我们通过利用RTPCR和qRT－PCR的方法检测了AS患者MSC中TLRs的表达，利用ELISA探讨TLRs激活对AS患者MSC中IL－6分泌的调控作用。

1　材料和方法

1.1　AS病人的入组及标本获取

AS病人来源于中山大学孙逸仙纪念医院门诊和住院的强直性脊柱炎患者，符合1984年修订的强直性脊柱炎诊断标准［7］，BASDAI≥4分，全部HLA－B27阳性。所有入组病例均告知其相关注意事项及可能风险并签署知情同意书方可入组。另外，在获得志愿者和病人的许可并签署知情同意书后实施骨髓的穿刺和收取，分离培养骨髓来源间充质干细胞。

1.2　材料

DMEM/低糖培养基（瓶装）购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；TLR3特异性刺激剂Poly（I：C）和TLR4特异性刺激剂LPS均来源于Sigma公司；流式特异性抗体均购买于BD公司；Trizol、逆转录试剂盒及SYBR green荧光染料购于TAKARA公司；引物设计和合成委托于广州英潍捷基公司；IL－6 ELISA试剂盒购自Roche公司。

1.3　方法

1.3.1　MSC的分离培养　AS病人骨髓被抽取后采用密度梯度离心法，1 000 r/min离心5 min，弃上清，重悬细胞沉淀，以2×106/cm2的密度接种于规格为25 cm2培养瓶中，置37℃、CO2饱和湿度培养箱中培养。3天左右进行一次换液操作，当细胞融合度达到80%～90%时，可考虑进行传代。选取第3～5代细胞用于实验。

1.3.2　AS患者MSC的流式鉴定　选择生长状态良好的AS－MSC，胰酶消化，离心，重悬细胞浓度为1×106/mL。分别孵育相应荧光标记的单克隆抗体及同型对照抗体（具体抗体信息见表1），1X PBS反复洗2～3次，上机进行流式细胞检测。选用同型IgG作为相应的阴性对照，检测细胞中相应表面抗原阳性表达率，单位用%表示。

1.3.3　检测AS患者MSC中所有TLRs的表达选择生长状态良好的AS－MSC，利用Trizol法提取RNA，测定RNA浓度后，按照10 μL逆转录体系合成cDNA；随后将cDNA进行RT－PCR反应合成相应的PCR产物（具体引物序列见表2）。制备2%琼脂糖，静置降温至40℃时添加5 μL荧光染料，慢慢摇匀充分混合，倒入制胶槽中，将5 μL样品PCR产物与1 μL Loading buffer充分混合，仔细加入上样孔中。电泳15～20 min，Bio－Rad凝胶成像仪紫外光下拍照分析。

1.3.4　检测AS患者MSC中TLR3和TLR4的表达　分别选取20例生长状态良好的AS患者MSC和正常人MSC，利用Trizol法提取RNA，测定RNA浓度后，按照10 μL逆转录体系合成cDNA；采用TAKARA试剂盒进行qRT－PCR试验，配好反应体系后按照试剂说明书的步骤上机进行RealTime PCR扩增和检测。采用10 μL反应体系，大致步骤如下：预变性：95℃20 s；变性：95℃10 s；退火：60℃20 s；延伸：60℃10 s；扩增40个循环。整个过程全程采集荧光信号，最后绘制融解曲线，根据扩增曲线和Ct值进行软件分析定量比较AS－MSC组和HD－MSC组中TLR3和TLR4基因表达的差异。（具体引物序列见表3）

1.3.5　TLR3和TLR4的激活对AS患者MSC分泌的调节作用　选择生长状态良好的MSC（P3－P5），随机选取AS－MSC和HD－MSC各5例，以密度105/mL接种6孔板，分为AS组、HD组。MSC贴壁后4 h，予以10 μg/mL Poly（I：C）和1 μg/mL LPS预刺激24 h，收集上清液，按照IL－6 ELISA试剂盒（ValukineTMELISA Kit，货号VAL102，Roche公司）说明书步骤加样，孵育，最后酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定其光吸收值（OD），根据标准品标准曲线计算得到上清液中IL－6的含量。

1.4　统计分析

数据以均值±标准差表示，所有数据均采用SPSS 17.0统计软件包行t检验，P＜0.05视为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1　AS患者MSC表达特定细胞表型

AS患者骨髓经原代培养后，及时换液洗去未贴壁细胞，当细胞生长融合至80%～90%时传代，第3代获取细胞纯度可达95%以上。成功分离的细胞均贴壁生长，细胞呈梭形或纺锤形，排列规律，按放射状或漩涡状同向排列。细胞生长图片大致如图1。流式分析结果显示AS－MSC表达特定的细胞表型，表面抗原CD29、CD44、CD105阳性表达率分别为97.2%，98.5%和96.4%，而CD34、CD45、HLA－DR阳性表达率较低，分别为5.3%，3.2%和2.9%，说明AS－MSC表达CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD45、HLA－DR，符合国际细胞治疗协会关于间充质干细胞细胞表型表达的鉴定标准［8］（见图1）。

2.2　AS患者MSC中所有TLRs表达的检测

为了明确AS患者MSC中TLRs的表达情况，我们提取了AS患者MSC的RNA，利用RT－PCR对目前已知的10种TLR均进行了检测（TLR1－TLR10）。PCR结果显示AS患者MSC中表达TLR1、2、3、4、5、6、8，几乎不表达TLR7、9、10，与文献报导基本一致［4］（见图2）。

图1　AS患者MSC的大体形态图A显微镜40倍镜下AS患者MSC的大体形态；B流式细胞分析术鉴定AS患者MSC中特定的细胞表型，AS－MSC表达CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD45、HLA－DR

图2　RT－PCR凝胶电泳检测AS－MSC中TLR1－10的表达情况HD为正常人MSCs，AS为患者MSCs。ASMSC和HD－MSC中表达TLR1、2、3、4、5、6、8，几乎不表达TLR7、9、10，与文献报导基本一致

2.3　AS患者MSC中TLR3和TLR4表达的检测

由于TLR3和TLR4已经被多项研究证实对MSC的免疫调节能力发挥至关重要的调控作用，我们特地加大样本量，分别抽取20例生长良好的AS患者MSC和正常人MSC，提取RNA，利用qRT－PCR进一步验证AS－MSC中TLR3和TLR4的基因表达情况。结果显示经过目的基因/内参基因比值计算并标准化后，以HD－MSC中目的基因的基因表达为1，AS－MSC中TLR2、TLR3及TLR4的基因表达分别为1.073、0.525和0.652，可见AS－MSC中TLR2的表达几乎无变化，TLR3较正常人降低47.5%，TLR较正常人降低了34.8%，与RT－PCR的结果基本一致（图3）。

图3　AS患者MSC中TLR2、TLR3和TLR4表达情况qRT－PCR检测结果显示AS－MSC中TLR2的表达几乎无变化，TLR3较正常人降低47.5%，TLR4较正常人降低了34.8%

2.4　TLR3和TLR4激活对AS患者MSC免疫调节能力的影响

为了了解表达异常的TLR3和TLR4是否具有功能性，TLR3和TLR4激活后是否对AS患者MSC的免疫调节功能具有调控作用。由于IL－6在 MSC发挥免疫调节功能起非常重要的作用，我们选择了检测激活AS患者MSC中TLR3和TLR4 后IL－6的分泌情况。结果显示TLR3和TLR4激活后，AS患者和正常人MSC中IL－6含量均升高。正常人MSC经TLR3和TLR4激活后，分别升高了5.0倍和10.2倍。但与基础值相比，TLR3和TLR4激活明显促进AS患者MSC中IL－6的分泌，分别升高8.3倍和13.8倍（图4）。

图4　TLR3和TLR4激活对AS患者MSC分泌IL－6的影响　ELISA检测结果显示TLR3和TLR4激活后，均能促进AS患者MSC和正常人MSC生成IL－6，但AS患者MSC对TLR激活促进作用更加明显。＊代表相同刺激条件下AS患者MSC和正常人MSC分泌IL－6相比有统计学差异，＃代表AS患者MSC或者正常人MSC分泌IL－6的量，跟各自无刺激基础值（None）相比有统计学差异

3　讨　论

强直性脊柱炎（AS）是血清阴性脊柱关节病的一种，通常好发于青年男性，由于骶髂关节和椎间广泛的炎症引起脊柱强直和全身炎性疼痛［9］。目前为止，AS的发病机制仍然不清。我们课题组前期的研究发现AS患者MSC的免疫调节能力异常可能是导致疾病发生的重要原因［3］。目前越来越多的证据支持TLR在MSC的免疫功能中起重要的调控作用［4，5，10］，但尚不清楚TLR是否在AS的MSC免疫调节中起关键作用。因此，我们设计了该实验旨在彻底地系统地探讨TLR在AS患者MSC免疫调节中的调控作用。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有多种分化潜能的，能够不断增殖的干细胞。MSCs来源非常丰富，可从人体的许多部位和组织中提取，主要有骨髓、脂肪组织、牙髓和脐带血［11－13］。因为骨髓来源途径可靠，细胞获取量大，传代质量较高，而且几乎不涉及伦理问题，故本实验主要选择抽取AS患者的骨髓，进行MSCs的分离、培养及鉴定。显微镜下显示AS患者骨髓分离培养出的细胞呈梭形，按放射状或旋涡状排列，在塑料培养瓶中贴壁生长。流式细胞分析表明我们从AS患者骨髓中分离培养出的细胞表达CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD45、HLADR，满足上述MSC鉴定的相关标准［8］，说明我们成功的从AS患者骨髓中分离并培养出了MSCs，可用于进一步的实验分析。

Toll样受体作为一种模式识别受体，在天然免疫宿主细胞识别和继发性免疫消除致病原中起着重要作用［14］。AS患者MSC中的TLR表达如何国内尚无相关报道。本实验RT－PCR发现ASMSC中表达TLR1、2、3、4、5、6、8，几乎不表达TLR7、9、10，与文献报导基本一致。另外，qRT－PCR结果均显示AS－MSC中的TLR3和TLR4的mRNA表达均较正常人降低，虽然与2011年Shervin Assassi等学者报导的AS患者外周血中TLR4和TLR5表达增加不一致［15］，我们考虑产生这些差异的原因可能是因为样本分别来自AS患者细胞和组织的不同。TLR3和TLR4激活后可显著增加AS患者MSC的免疫调节功能，明显促进IL－6的分泌功能。由于IL－6在调节幼稚CD4＋T细胞向Th17和Treg分化中起着关键的　“闸口作用”［16］，AS患者MSC中TLR3和TLR4激活后IL－6的大量分泌可能正是导致其免疫调节功能异常，引发全身持续性炎症的重要致病原因。当然，TLR3和TLR4激活是具体通过什么信号通路促进AS患者MSC生成IL－6值得进一步研究。

参考文献

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An experimental study of Toll-like receptors regulation of mesenchymal stem cell in ankylosing spondylitis

LI Yuxi，WANG Peng，XIE Zhongyu，LI Jinteng，SHEN Huiyong.Department of Orthopedics，Sun Yat-sen Memorial Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510120，China.Corresponding author：SHEN Huiyong，shenhuiyong@aliyun.com.

【Abstract】　Objective To detect the expression of Toll-like receptors（TLRs）on mesenchymal stem cells（MSCs）　from ankylosing spondylitis（AS）　patients and investigate their effect on immunoregulatory function of AS-MSCs.Methods　First，flow cytometry was used to determine whether the specific immunophenotype were expressed on the cells cultured from the bone marrow of AS patients.Then，the expression of all TLRs on AS-MSCs was detected by the RT-PCR and the TLR3 and TLR4 were further measured by the qRT-PCR.Finally，after the TLR3 and TLR4 were activated by their specific ligands，ELISA was used to detect the secretion of IL-6.Results　The ASMSC expressed CD29，CD44 and CD105，but not CD34，CD45 or HLA-DR.The results from RT-PCR showed that AS-MSC expressed TLR1，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR6 and TLR8 and seldom expressed TLR7，TLR9 or TLR10.In addition，the expression of TLR3 and TLR4 in AS-MSC were respectively reduced to 47.5%and 34.8%，compared to the healthy donors.Ligation of TLR3 and TLR4 can improve the IL-6 secretion of MSCs to 8.3 folds and 13.8 folds respectively in AS patients.Conclusion　The expression and function of TLR3 and TLR4 were abnormal in MSCs from AS patients，and they may play a key role in the immunoregulatory dysfunction of AS-MSCs.

【Key words】Ankylosing spondylitis；Mesenchymal stem cells；Toll-like receptors

收稿日期：（2015－12－26）

*通讯作者：沈慧勇，Email：shenhuiyong@aliyun.com

基金项目：国家自然科学基金（81271951）；国家自然科基金8140185）；广东省高校强直性脊柱炎综合诊治工程技术中心（GCZX－A1301）；广东省科技计划项目（2015B020228001）广东省科技计划项目（2015B090903059）

doi：10.3969/j.issn.1009－976X.2016.01.003

中图分类号：R681.5＋1

文献标识码：A

作者单位：510120广州中山大学孙逸仙纪念医院骨科