岭南现代临床外科 ›› 2019, Vol. 19 ›› Issue (06): 701-705.DOI: 10.3969/j.issn.1009?976X.2019.06.012
方松城， 修霞， 麦潋曦， 谢舒乐， 林钊宇， 焦九阳*
FANG Songcheng， XIU Xia， MAI Lianxi， XIE Shule， LIN Zhaoyu， JIAO Jiuyang
摘要：
舌鳞癌是口腔癌中发病率最高的恶性肿瘤，55岁左右的人群为舌鳞癌高发群体，但近年来逐渐呈现年轻化的趋势［1，2］。目前已知多种因素均能导致舌鳞癌的产生，但具体发生机制尚不明确［3］。寻找新的关键基因或标志物利于舌鳞癌的深入认识，也有助于舌鳞癌的早期诊断、靶向治疗以及改善患者预后［4，5］。
Long non-coding RNA（lncRNA）是长度大于200 nt一类非编码RNA，其作用广泛，机制复杂。近年来研究发现lncRNA可以参与多种生物学功能，同时也是癌症相关的重要调控因子［6，7］。长非编码RNA PANDAR是定位于人类第6号染色体上的一种非编码RNA，其长度约为1500 bp，研究发现它与p53存在相互作用，能够调控多种凋亡相关蛋白的表达［8，9］。BAX（Bcl-2 associated X protein，BAX）基因属于Bcl-2家族成员，广泛表达于多种组织，能够促进细胞凋亡［10，11］。已有研究发现BAX与多种恶性肿瘤的发生发展相关，包括肝癌，乳腺癌等［12，13］。目前尚未见到PANDAR与舌鳞癌的相关研究。本研究将探讨PANDAR在舌鳞癌中的表达及生物学功能，并检测PANDAR与BAX在舌鳞癌中的关系。
1.1.1 临床样本及细胞系 收集东莞东华医院口腔科及中山大学孙逸仙纪念医院口腔颌面外科2016年2月至2018年5月手术切除的舌鳞癌及其癌旁组织共51例，所有舌鳞癌病例均有病理学诊断证实，其中男 27例，女24例，年龄（54.6±9.5）岁。所有患者均已被告知并签署由本院伦理委员会批准的知情同意书。口腔癌细胞系Cal27，SCC9，SCC25，HSC3，HSC6和HOK购自中国科学院细胞库（上海）。
1.1.2 试剂 Lipofectamine 3000购买于美国Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit购买自日本TAKARA公司；Bax抗体购买自CST公司，GAPDH抗体购自Proteintech公司购买。si-NC序列为：GTAGTGAGATGCAGATGATAA，siRPANDAR#1序列为 GCAATCTACAACCTGTCTT，siRPANDAR#2序列为TTTCGAACGGAACAGAGACUUAUACAGATT，由广州锐博生物有限公司合成。RPANDAR qRTPCR上游引物序列为CTGTTAAGGTGGTGGCATTG，RPANDAR下游引物序列为GGAGGCTCATACTGGCTGAT。
1.2.1 细胞培养 Cal27，HSC3，HSC6和HOK细胞用含10%FBS（Gibico）的DMEM培养基培养。SCC9和SCC25细胞用含10%FBS（Gibico）的DMEM/F12培养基培养。放置于37℃，5%CO2的培养箱中，取生长对数期细胞进行实验。
1.2.2 RNA提取及qRT-PCR TRIZOL法提取组织及细胞中的总RNA，PrimeScriptTM RT reagent Kit反转为相应的cDNA。按照SYBR Green PCRMaster Mix的说明书，以cDNA为模板进行qRT-PCR检测，以GAPDH为内参进行表达量的计算。
1.2.3 siRNA的转染 取对数生长期的舌鳞癌细胞接种于6孔板中，至细胞融合度达到70%左右时，按照Lipofectamine 3000的说明书对转染适量的siRNA及相应的对照siRNA。转染6～8小时后更换新鲜培养基，并于转染的48小时后收集细胞沉淀。
1.2.4 CCK8检测 将转染PANDAR siRNA及对照siRNA后的Cal27和SCC25细胞消化并接种于96孔板，放置与37℃，5%CO2的培养箱中培养。之后在 24 h，48 h，72 h每孔分别加入 10μL的CCK-8，利用酶标仪450 nm检测相应OD值，并绘制增殖曲线。
1.2.5 细胞凋亡检测 收集转染48小时后的细胞，按照Annexin V-FITC Apoptosis Staining/Detection试剂盒的说明书（美仑生物），对细胞进行标记，并利用流式细胞分析仪进行检测。
1.2.6 蛋白质印迹法（Western blot） 收集细胞沉淀，用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞。离心收集上清，加入5×loading buffer，100℃煮5分钟。准备SDS-PAGE胶，取适量样品上样。80 V恒压30分钟，120 V恒压1小时，进行转膜。封闭1小时后，分别使用Bax和GAPDH一抗4℃过夜。TBST洗膜3次后，孵育二抗1小时。TBST洗膜3次后，加入ECL发光液进行曝光。
1.2.7 统计学分析 采用GraphPad Prism 7软件进行分析，qRT-PCR和细胞增殖及凋亡率的差异显著性用的是Student t检验进行统计。P值小于0.05则认为差异显著，*表示 P＜0.05，**表示 P＜0.01，***表示P＜0.001。
我们在51例舌鳞癌及其癌旁正常组本中检测PANDAR的表达水平，与癌旁组织相比PANDAR在舌鳞癌的表达显著升高（P＜0.05）（图1A）。此外，与永生化的正常口腔上皮细胞株HOK相比，PANDAR在多数舌鳞癌细胞株内表达上调，其中Cal27和SCC25细胞上调最为显著（图1B）。
图1 PANDAR在舌鳞癌组织和细胞内的表达 A：51例舌鳞癌组织及癌旁组织中PANDAR的表达情况；B：不同舌鳞癌细胞系Cal27，SCC9，SCC25，HSC4，HSC6及对照细胞NOK中PANDAR的表达水平。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
我们分别转染PANDAR-specific siRNA及对照NC-specific siRNA到Cal27及SCC25中，48小时后收集细胞。利用qRT-PCR检测PANDAR-specific siRNA的敲低效率，验证siRNA的效果，结果发现两条siRNA在两种细胞系中均有良好的敲低效率（图2A）。我们进一步研究敲低PANDAR表达对舌鳞癌增殖的影响。我们分别选取转染后24小时，48小时，72小时的Cal27及SCC25细胞，利用CCK-8试剂盒检测450 nm下的OD值，并绘制相应曲线（图2B）。结果发现，在两种细胞中，敲低PANDAR的表达均能够有效抑制舌鳞癌细胞的增殖。
图2 沉默PANDAR显著抑制舌鳞癌细胞增殖 A：在Cal27和SCC25细胞中，PANDAR-siRNA特异性敲低后，PANDAR的表达情况；B：在Cal27和SCC25细胞内PANDAR特异性敲低后，细胞的增殖情况。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
在明确了PANDAR能够有效促进舌鳞癌增殖的基础上，我们进一步使用Annexin V-FITCApoptosis Staining/Detection试剂盒检测PANDAR对舌鳞癌细胞凋亡的作用。将PANDAR-specific siRNA及对照NC-siRNA转染至Cal27及SCC25细胞48小时后，收集细胞进行Annexin V-FITC染色并利用流式细胞仪对PANDAR敲低前后舌鳞癌细胞的凋亡水平进行检测。结果发现在两种舌鳞癌细胞中，敲低PANDAR能够显著促进舌鳞癌细胞的凋亡（图3A和B）。
图3 沉默PANDAR显著促进舌鳞癌细胞凋亡 A：在Cal27细胞中，PANDAR-siRNA特异性敲低后，细胞凋亡情况；B：在SCC25细胞内PANDAR特异性敲低后，细胞的凋亡情况。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
有研究发现PANDAR与p53存在相互作用，并能影响 Bcl-2 家族凋亡相关基因的表达［14，15］。由此，我们推测在舌鳞癌中，PANDAR可能影响了p53相关通路及Bcl-2家族相关蛋白。为了验证这种设想，我们分别向Cal27及SCC25中转染PANDAR-specific siRNA及对照NC-siRNA，48小时后收集细胞，分别检测BAX，PUMA，NOXA和BID的mRNA及相应蛋白的表达水平（图4A-D）。结果发现敲低PANDAR后，促凋亡基因BAX的mRNA及蛋白的表达水平均发生了明显的上调（P＜0.05）。
图4 沉默PANDAR对凋亡相关蛋白的影响 A：在Cal27细胞中，转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后，凋亡相关基因BAX，PUMA，NOXA和BID mRNA的表达水平；B：在Cal27细胞中，转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后，BAX蛋白表达的变化；C：在SCC25细胞中，转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后，凋亡相关基因BAX，PUMA，NOXA和BID mRNA的表达水平；D：在SCC25细胞中，转染PANDAR-siRNA及NC-siRNA 48小时后，BAX蛋白表达的变化。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01
近年来，大量研究发现lncRNA广泛参与调控细胞的多种生物功能，包括细胞分化，细胞增殖，细胞凋亡等，其中与肿瘤的相关性也不断被揭示［16，17］。虽然 UCA1、MEG3 和 MALAT1 已被证实参与舌鳞癌的进展［18-20］，但是仍未能完全揭示lncRNA对舌鳞癌发生发展的调控作用。
在前期研究中，我们收集舌鳞癌及癌旁组织进行lncRNA表达谱分析，并鉴定出了一批在舌鳞癌组织内显著高表达的lncRNA［21］，其中PANDAR在舌鳞癌组织内显著高表达其排名靠前，而目前没有关于PANDAR与口腔癌的相关报道。PANDAR定位于人类第6号染色体上，长约1500 bp，在DNA损伤的情况下可以参与p53通路介导凋亡作用，并能够调控部分凋亡相关蛋白［14］。同时，已有研究证实PANDAR与肝癌、胃癌的肿瘤生物学行为密切相关［8，14，22］。本课题对 PANDAR 在舌鳞癌中的表达及功能进行初步研究。首先，我们在51例舌鳞癌及其癌旁组织和舌鳞癌细胞株中检测了PANDAR的表达，PANDAR在舌鳞癌组织和大部分舌鳞癌细胞株内中显著高表达，其中Cal27及SCC25中PANDAR的表达最为突出。因此，我们利用舌鳞癌细胞系Cal27及SCC25研究了PANDAR对舌鳞癌细胞的增殖与凋亡的影响。功能研究显示，在舌鳞癌细胞中转染PANDAR-siRNA和NC-siRNA后Cal27和SCC25细胞的增殖能力被有效抑制，且舌鳞癌细胞的凋亡显著增加。有研究证实PANDAR与p53介导的凋亡通路密切相关，而p53通路能够调控Bcl-2家族的多种凋亡相关基因的表达［8］。因此，我们推测PANDAR可能是通过p53通路调控Bcl-2家族凋亡相关蛋白的表达，继而影响了舌鳞癌细胞的增殖与凋亡。随后，我们检测了p53下游的凋亡相关基因的表达，包括BAX、PUMA、NOXA、BID［23］。结果显示，沉默PANDAR后促凋亡基因BAX的mRNA水平和蛋白水平都发生了明显的上调，说明PANDAR是通过抑制p53下游的促凋亡基因BAX的表达，进而促进舌鳞癌细胞的增殖并抑制其凋亡。
目前已有研究证实在PANDAR在瘤内的高表达往往与患者的不良预后成密切相关［14，15，24］，我们将在之后的研究中收集更多的舌鳞癌样本检测PANDAR的表达，分析PANDAR的表达与舌鳞癌患者临床病理特征及预后的关系。lncRNAs可以通过改变染色体构象，维持mRNA稳定性，调控靶基因转录，参与蛋白质翻译后修饰等在转录水平上调控下游靶基因［25，26］。PANDAR 有可能采用上述一种方式调控BAX的表达，我们将在后续实验中通过ChIRP-seq实验，研究与PANDAR有结合的DNA；或通过RNA pulldown实验，研究与PANDAR结合的蛋白。
综上所述，PANDAR在舌鳞癌组织及细胞内显著高表达，敲低PANDAR后抑制促凋亡基因BAX在mRNA和蛋白水平的表达，进而抑制了舌鳞癌细胞的增殖，并促进其凋亡。
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The role of lncRNA PANDAR in tongue squamous cell carcinoma
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