骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠骨折愈合的研究

常瑞明1王鹏2杨涛2陈锦武1常建星3*

【摘要】目的 检测促炎因子TNF?α、IL?6及抗炎因子IL?4、IL?10以及Toll样受体4在骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠骨折愈合过程中的动态变化，探讨炎症失衡在此过程中的作用及可能机制。方法 7～8周龄SPF级雄性自发性2型糖尿病GK大鼠56只，喂养高脂饲料造模。造模成功后（随机血糖≥11.1 mmol/L）暴露大鼠左侧股骨，人为造成开放性骨折并给与克氏针复位内固定，将培养收集浓缩的骨髓间充质干细胞注射于骨折周围肌肉软组织，于实验后第1周、3周、6周、8周分别行X线摄片、下腔静脉取血测定炎症因子、骨折局部软组织检测TLR4表达。结果 术后第1周、3周、6周、8周对照组TNF?a、IL?6、TLR?4表达均高于实验组（P＜0.05），而IL?4、IL?10则低于实验组（P＜0.05）；两组动物在手术后第三周均可见骨折处骨痂生长，实验组更加明显，但对照组骨痂不均匀，骨密度较低。结论 骨髓间充质干细胞局部移植可以降低GK糖尿病大鼠骨折后机体的炎症反应，促进骨折愈合。

【关键词】骨髓间充质干细胞；GK糖尿病大鼠；炎症反应因子；Toll样受体4；骨折愈合

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

GK大鼠60只，雄性，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号码（SCXK（沪）2012?2002；高脂饲料购于上海普路腾生物科技有限公司；骨髓间充质干细胞购于Cyagen Biosciences Inc.兔抗鼠 TLR4抗体购于 Cell Signaling（Boston，MA，US）；内 参 抗 ?GAPDH 购 于 USBiological（Swampscott，MA，US）；鼠 TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10 ELISA Kit购于达科为生物技术公司。

1.2 实验方案

雄性7～8周龄GK大鼠给于高脂饲料喂养2周，测随机血糖≥11.1 mmol/L认为造模成功。大鼠随机分为实验组和对照组各28只。（1）实验组：大鼠在行手术后立即在骨折复位周围肌肉软组织处注射浓缩好的骨髓间充质干细胞（2×106个/mL）；（2）对照组：术后在手术部位处注射同等剂量的无菌生理盐水。然后两组动物分笼饲养，自由饮水、摄食。

大鼠截骨内固定模型：戊巴比妥钠（45 mg/kg）腹腔注射麻醉满意后，俯卧位固定于手术实验台，股骨外后方做约1.5 cm切口，逐层分离，暴露股骨中段，用电动摆锯横型离断股骨，复位后用克氏针内固定，然后逐层缝合。手术过程见图1。

1.3 骨髓间充质干细胞培养

鼠骨髓间充质干细胞细胞株在超净台下复苏培养，定期换液、传代，于手术当天取指数生长期的细胞进行浓缩制成细胞悬液（2×106个/mL），准备注射。

1.4 标本采集

于术后第1周、第3周、第6周、第8周麻醉后行骨折处摄片，下腔静脉取血后即刻离心，取骨折处肌肉软组织即刻-80℃低温冰箱保存待测。

图1 模型制作过程图解

1.5 酶联免疫吸附测定法（ELISA）

参照厂家说明书测定血液当中TNF?α、IL?6、IL?4、IL?10含量。

1.6 Western blot测定TLR?4表达

过程简述：取股骨骨折周围骨膜及肌肉软组织，BCA蛋白定量试剂盒进行总蛋白测定（Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford，USA）。取上述蛋白样品各20μg，进行SDS?PAGE电泳和Western blotting分析。蛋白样本加缓冲液混合，100℃变性处理5 min，蛋白上样于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用60 V进行浓缩胶电泳，时间20 min，120V在分离胶中电泳，60 min，电泳至溴酚蓝刚跑出即终止电泳。电泳后转印至PVDF膜上，封闭2小时，4℃孵育特异性一抗，过夜，一抗反应结束后与HRP标记的特异性二抗室温孵育1 h，TBST洗膜，15 min×3次；用化学发光法（ECL）显影。Adobe Photoshop 7.0分析条带光密度。

1.7 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析，符合正态分布的实验数据用均数±标准差表示，组内比较用方差分析，组间用t检验，显著性水准为P小于0.05。

2 结 果

2.1 血清炎症因子的测定

GK糖尿病大鼠经开放骨折内固定后不同时间点测定血液中炎症因子的含量。实验组促炎因子TNF?α、IL?6在第1周、第3周、第6周、第8周均低于对照组（P＜0.05），而抗炎因子IL?4、IL?10在对应时间点均高于对照组（P＜0.05）；有趣的是结果发现促炎和抗炎因子的变化在第一周到第三周的变化幅度较大，第三周至第八周变化幅度趋于平稳，这说明炎症反应在术后三周内较为剧烈，之后逐渐平稳下来。见表1、表2。

2.2 骨折处软组织TLR?4的表达

大鼠于手术后第1周、第3周、第6周、第8周分别取骨折周围肌肉、骨膜等软组织测定其TLR?4的表达，结果显示实验组TLR?4表达在对应时间点均低于对照组（P＜0.05）（图2）。

2.3 术后大鼠不同时间点骨折愈合的X线表现

术后第一周实验组和对照组均未见明显的骨痂生长，术后第三周骨折处开始有较明显的骨痂生长，实验组术后第六、第八周骨折处逐渐愈合，骨皮质连续，骨密度均匀；对照组虽然也有逐渐愈合的趋势，但骨质密度明显不均匀，骨痂生长状况不如实验组（图3）。

图2 不同时间点骨折处软组织TLR-4的表达

3 讨 论

炎症反应在糖尿病发病机制中的作用越来越被研究者认识［2］。但糖尿病足的神经病变、血管病变、难以控制的感染仍然是临床棘手问题，而糖尿病足引起的骨质破坏（特别是夏克氏足）是致残的重要因素［3］。骨科研究者试图通过矫正融合植骨等手段重建足部的正常骨骼形态，为足部溃疡愈合、回复足部的行走承重功能提供条件，但术后骨质延迟愈合甚至不愈合成为难以逾越的难关［4］。

图3 骨折愈合的X线表现

骨髓间充质干细胞来源广泛，在一定条件下可以定向分化成软骨细胞、成骨细胞等，具有促进骨折愈合的能力［5］，但局部注射骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠骨折愈合的研究报道较为少见。本实验旨在研究骨折周围局部注射浓缩后的骨髓间充质干细胞对糖尿病大鼠骨折内固定术后骨折愈合过程中炎症因子、TLR?4的动态变化，结合骨折处X线显示骨痂生长情况，探讨炎症反应在其中的作用。

TNF?α、IL?6是具有代表性的促炎因子，IL?4、IL?10是经典的抗炎因子代表，正常情况下机体处于促炎抗炎动态平衡状态［6］。TLR?4是一类跨膜蛋白模式识别受体，在机体的免疫应答和炎症反应中发挥重要作用，TLR?4是其中非常重要的一类。它识别病原体后向细胞内传递信号，激活多种核转录因子，诱导促炎因子的产生，打破抗炎?促炎平衡［7］。本实验结果显示实验组在术后第1、第3、第6、第8周促炎因子TNF?α、IL?6均低于对应时间点的对照组，而抗炎因子IL?4、IL?10均高于对应时间点的对照组，骨折处肌肉软组织中TLR?4的表达均低于对应时间点的对照组，这些结果说明炎症反应对糖尿病大鼠骨折内固定术后骨折的愈合过程有影响。本实验还发现，在大鼠骨折内固定术后第1周到第3周时间段炎症反应的变化幅度较大，第3周后逐渐趋于平稳状态，说明骨折内固定术后早期（3周内）炎症反应较剧烈。

术后第1周、第3周、第6周、第8周两组X线结果显示随着时间的推移，骨折处逐渐均有骨痂形成，骨皮质逐渐形成连续，但实验组大鼠骨折内固定后骨折处骨痂生长情况在对应时间点明显优于对照组，而且骨质密度均匀，愈合处骨形态规整。

结合本实验结果说明骨髓间充质干细胞局部注射可促进糖尿病大鼠骨折的愈合，可能与注射干细胞后抑制机体的促炎因子形成、促进抗炎因子的释放有关。骨髓间充质干细胞来源丰富，易于培养，局部注射方法简便，期望在临床上能有更广阔的应用前景。

参考文献

［1］ Wallner C，Abraham S，Wagner JM，et al.Local application of isogenic adipose?drived stem cells restores bone healing capacity in a type 2 diabetes model［J］.Stem Cells Transl Med，2016，5（6）：836-844.

［2］ Chen Z，Zhao GH，Zhang YK，et al.Research on the correla?tion of diabetes mellitus complicated with osteoporosis with lipid metabolism，adipokines and inflammatory factors and its regres?sion analysis［J］.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（17）：3900-3905.

［3］ Pinzur MS.Charcot's foot［J］.Ankle Clin，2000，5（4）：897-912.

［4］ Shibuya N，Humphers JM，Fluhman BL，et al.Factors associat?ed with nonunion，delayed union and malunion in foot and ankle surgery in diabetic patients［J］.J Foot Ankle Surg，2013，52（2）：207-211.

［5］ Xue D，Zhang W，Chen E，et al.Local delivery of HMGB1 in gelatin sponge scaffolds combined with mesenchymal stem cell sheets to accelerate fracture healing［J］.Oncotarget，2017，8（26）：42098-42115.

［6］ Zhou Y，Yu X，Chen H，et al.Leptin deficiency shifts mast cells toward anti?inflammatory actions and protects mice from obesity and diabetes by polarizing M2 macrophages［J］.Cell Metab，2015，22（6）：1045-1058.

［7］ Hu CH，Song ZH，Xiao K，et al.Zinc oxide influences intestinal integrity，the expressions of gene associated with inflammation and TLR4 myeloid differentiation factor 88 signaling pathways in weanlingpigs［J］.Innate Immun，2014，20（5）：478-86.

Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on fracture healing in diabetic rats

CHANG Ruiming1，WANGPeng2，YANGTao2，CHENJinwu1，CHANGJianxing3.
1Boji Medical Center，2Department of Emergency，3Department of Genaral Surgery，Sun Yat?sen Memorial Hospital，Sun Yat?sen University，Guangzhou 510120.Corresponding author：CHANGJianxing，chang_jianxing@aliyun.com

【Abstract】Objective To study the role of inflammation imbalance on mesenchymal stem cells promoting fracture healing in a model of GK diabetic rats by detecting the dynamic changes of the level of inflammation factors TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of Toll?like receptor?4（TLR?4）.Methods The diabetic model on GK rats was induced by feeding high?fat diet（random blood sugar≥11.1 mmol/L）.The fracture was fixed with kirschner wire after the left thigh?bone of rats were exploded and sawed off，and then the concentrated stem cells were injected into the local area of the fracture.We collected the blood and tissue specimen to detect the concentrations of TNF?α，IL?6，IL?4，IL?10 and the expression of TLR?4 in one week，three week，six week and eight week after fracture fixation.The fracture healing was evaluated by X?ray.Results Thelevelsof TNF?α，IL?6 and the expression of TLR?4 were higher in the control group than those in the experimental group（all P values ＜ 0.05），however，the levels of IL?4 and IL?10 were lower in the control group（all P values ＜ 0.05）.The osteotylus forma?tion was more obvious and the bone mineral density was more homogeneous in the experimental group.Conclusion In the present study，our findings demonstrated that the local transplantation of bone mar?row mesenchymal stem cells reduced the inflammatory response and promote fracture healing fracture in diabetic GK rats.

【Key words】mesenchymal stem cells；GK diabetic rats；inflammatory factors；TLR?4；fracture

中图分类号：中图分类号：R683 文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1009?976X.2017.05.014

基金项目：广东省科技计划项目（2013B060300008）

作者单位：510120 广州 中山大学孙逸仙纪念医院1博济医疗中心；2急诊科；3普外科*通讯作者：常建星，Email：chang_jianxing@aliyun.com

随着人们生活水平的提高，生活方式的改变，糖尿病的发病率呈现出逐年升高、年轻化的态势。糖尿病血管病变、神经病变等并发症给患者带来严重后果，其中，糖尿病足导致的高致残率更是给患者带来严重的负担，给社会带来巨大的经济损失。糖尿病足出现足部骨质的破坏，导致足踝部畸形，溃疡难以愈合。诸多学者试图通过矫形手术矫正畸形，为足部溃疡愈合提供条件，但是术后骨折愈合困难甚至不愈合成为一个棘手的问题。近年来有报道应用骨髓间充质干细胞促进骨折愈合［1］，但局部注射的研究报道未见。炎症反应在糖尿病发生发展中的重要作用越来越受到人们的普遍重视，本研究探讨骨髓间充质干细胞促进糖尿病大鼠骨折愈合过程中炎症间质及Toll样受体4（TLR?4）的动态变化，为糖尿病骨折术后的愈合提供理论依据。

（收稿日期：2017-08-26）